In biologia molecolare, una buona scelta del tampone e la preparazione per le diverse fasi di isolamento del DNA possono essere la differenza tra il passaggio all'espressione proteica o l'apertura di un altro kit di maxi-preparazione per ricominciare. Nonostante la loro cruciale importanza, le ricette tampone sono spesso proprio questo: ricette scritte senza spiegazione o razionalità per le diverse componenti. Uno di questi è il glucosio-tris-EDTA o il GTE buffer.
$config[code] not foundPer cosa viene utilizzato GTE?
GTE viene utilizzato per risospendere le palline delle cellule batteriche prima di lisare (rompere le cellule) e raccogliere il DNA plasmidico all'interno. Il lisozima, che ammorbidisce le membrane cellulari, viene spesso aggiunto insieme al tampone GTE. Raggiungere una sospensione omogenea di cellule intere durante questa fase in modo che la soluzione di lisi aggiunta successivamente possa raggiungere tutte le cellule è la chiave per ottenere buoni rendimenti di DNA. GTE è progettato per farlo mentre fornisce anche un ambiente stabile per il DNA.
Glucosio per osmolarità
Zucchero al glucosio 50 milligradi (millimolare) viene aggiunto al tampone GTE per mantenere l'osmolarità dove la concentrazione di soluto all'esterno delle cellule è vicina a quella all'interno delle cellule. Ciò impedisce la lisi cellulare precoce, che può causare rese inferiori del DNA a causa dell'aggregazione e della degradazione. Anche gli altri componenti del buffer contribuiscono all'osmolarità della soluzione, ma il glucosio, essendo un non elettrolita, è una buona scelta perché non interferisce con le proprietà del buffer della soluzione.
Tris per la stabilità del pH
Tris è il nome breve per tris (idrossimetil) amminometano, che è un tampone pH molto comune. Nel caso del tampone GTE, il sale acido (Tris-HCl) viene aggiunto al buffer ad una concentrazione di 25 mM. Ciò mantiene il pH della soluzione a un valore di circa 8,0 fisiologico, un pH ideale per prevenire l'idrolisi acida (degradazione) del DNA plasmidico e reazioni collaterali indesiderate degli altri componenti cellulari.
EDTA previene la degradazione del DNA
L'EDTA, o acido etilendiamminotetraacetico, cattura o "chela" gli ioni metallici fuori dalla soluzione, impedendo loro di partecipare a reazioni collaterali indesiderate. Nel buffer GTE, EDTA viene aggiunto a 10 mM. Il suo scopo principale è nel buffer di arrotondare zinco libero, magnesio e calcio, prevenendo così la degradazione del DNA da alcuni percorsi che richiedono quei metalli.
Alcuni consigli importanti
Tieni freddo il tuo tampone GTE e fallo in piccole quantità per prevenire la crescita di batteri non intenzionali. Lo zucchero e il pH controllato costituiscono un ottimo mezzo di crescita. Usa sempre acqua purificata. L'acqua del rubinetto può avere un eccesso di ioni metallici dai tubi, che può sopraffare la capacità dell'EDTA di catturare. Se si sospetta la presenza di RNA interferente nel campione, aggiungere RNase A a 100 microgrammi per millilitro al tampone GTE per eliminare il problema.
